原代心肌細胞研究要注意些什么？

　　作為主要的研究模型，原代心肌細胞被廣泛應用于心血管研究。那么我們在研究過程中都要注意些什么呢？

　　1、新生鼠年齡的選擇新生鼠心肌細胞在出生后3天內具有部分增殖能力，而成年鼠心肌細胞為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時間越短，離體心肌細胞存活率越高，越容易貼壁。大量觀察表明，選擇1～3日齡大鼠分離心肌細胞進行原代培養(yǎng)是理想的，尤其是半日齡大鼠。

　　2、消化酶的選擇和使用

　　新生大鼠原代心肌細胞間可采用組織塊法和消化法分離。前者較少使用，因為難以獲得密度均勻的細胞和控制成纖維細胞的生長。消化法中常用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶I或II和透明質酸酶。透明質酸酶主要與胰蛋白酶或膠原酶結合使用。胰蛋白酶作用強，容易對心肌細胞造成損傷。膠原酶作用溫和，能消化細胞間質中的膠原纖維，釋放細胞，對細胞損傷小。在新生大鼠的心肌組織中，膠原酶Ⅰ主要是膠原Ⅰ。文獻報道膠原酶的工作濃度一般為0.6～1G·L1，我們采用0.8g·L1。現(xiàn)在最好用膠原酶。

　　3、掌握消化程度

　　新生大鼠心肌細胞對酶消化非常敏感，過度消化會導致肌原纖維，增加細胞死亡率或失去粘附和搏動性；由于消化不充分，細胞聚集成簇，難以區(qū)分細胞邊界和形態(tài)觀察。在消解過程中使用磁力攪拌器時，應注意1）轉速一般控制在60～80R·Min1左右。(2)每次消化的時間必須結合消化酶的濃度來確定。(3)吹走粘附在攪拌器上的心肌組織，使酶液充分接觸組織。(4)適宜的溫度為35～37℃(5)當組織由紅變白并呈半透明狀時，應停止消化。

　　4、接種細胞密度

　　原代心肌細胞間的接種密度不僅影響細胞間的相互接觸，從而影響細胞對肥大刺激的反應，而且影響長期培養(yǎng)細胞的存活率。應準確計算接種細胞的絕對數(shù)。一般來說，單位面積的細胞數(shù)應根據(jù)實驗的觀察目的來確定。